甲胎蛋白（AFP）與人血清白蛋白的結(jié)構(gòu)對(duì)比分析

目前對(duì)AFP的研究主要集中在其作為腫瘤/妊娠標(biāo)志物的作用及其細(xì)胞生物學(xué)功能，而對(duì)AFP蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的研究近年來(lái)較少關(guān)注。對(duì)甲胎蛋白結(jié)構(gòu)的直接觀察始于1983年，Luft等人將暗場(chǎng)電子顯微鏡與激光輔助光學(xué)系統(tǒng)相結(jié)合，獲得了人甲胎蛋白分子的“V”形圖像。圓二色、熒光光譜、掃描微量熱等技術(shù)已被用于研究AFP的二級(jí)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，以及其蛋白質(zhì)性質(zhì)，如穩(wěn)定性和配體結(jié)合。Vladimir N. Uversky的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AFP在各種條件下（如pH 4.5-10.5；低于70℃；低于2.0 M鹽酸胍或7.5 M尿素）具有很高的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。雖然AFP的三維模型已經(jīng)被模擬和利用，但AFP的真實(shí)構(gòu)象仍然難以捉摸。

研究人員利用HEK 293F細(xì)胞系制備了重組AFP，并利用單粒子冷凍電鏡（cryo-EM）成功地鑒定了其結(jié)構(gòu)；詳細(xì)分析了其結(jié)構(gòu)特征，并與人血清白蛋白（HSA）進(jìn)行了系統(tǒng)比較。

1. AFP結(jié)構(gòu)分析

為了研究AFP的結(jié)構(gòu)特征，研究人員通過(guò)HEK 293F懸浮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)C端帶有2x Strep標(biāo)簽的重組AFP。通過(guò)Western blotting確定獲得的蛋白為AFP蛋白（圖1c），尺寸排阻色譜和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)結(jié)果顯示重組AFP純度較高（圖1a，b），瞬時(shí)表達(dá)獲得的重組AFP蛋白可用于冷凍電鏡分析。

研究人員使用cryo-SPARC錄制和處理了不同狀態(tài)的AFP視頻（圖2a，b）。經(jīng)過(guò)運(yùn)動(dòng)校正和對(duì)比度傳遞函數(shù)估計(jì)，根據(jù)0.143的金標(biāo)準(zhǔn)傅立葉殼相關(guān)性（圖2d和補(bǔ)充圖1），以3.31?的總分辨率生成了cryo-EM圖，顯示了良好的側(cè)鏈密度（圖2c）。這使得研究人員能夠?yàn)锳FP建立精確的原子模型（圖2e）。

AFP具有心臟樣不對(duì)稱形狀，尺寸為93.2 ?×83.3 ?×59.6 ?，體積為36030 ?³。在三維結(jié)構(gòu)中觀察到全長(zhǎng)AFP具有信號(hào)肽（殘基1-18）和成熟蛋白（殘基19-609）。AFP主要由α-螺旋組成，約占其二級(jí)結(jié)構(gòu)的69%，α-螺旋由環(huán)狀區(qū)域連接（圖2e和圖4）。AFP有三個(gè)結(jié)構(gòu)域：I、II和III，進(jìn)一步細(xì)分為IA、IB、IIA、IIB、IIIA和IIIB亞結(jié)構(gòu)域。這些亞結(jié)構(gòu)域由4-6個(gè)螺旋組成，并產(chǎn)生潛在的配體結(jié)合位點(diǎn)（圖2e）。

圖1.AFP的提取和純化

注：a.甲胎蛋白的尺寸排阻色譜圖，AFP的洗脫峰為單峰，且對(duì)稱，體積為2.12 mL。b.從尺寸排阻色譜組分中純化的AFP SDS-PAGE分析結(jié)果。當(dāng)使用含有還原劑β-巰基乙醇的上樣液時(shí)，還原的AFP分子量約為85 kDa。非還原的AFP分子量約為70 kDa。c.純化的AFP Western blot分析結(jié)果；用Strep抗體進(jìn)行免疫染色。

圖2.AFP的冷凍電鏡分析

注：a.從300kv Titan Krios顯微鏡上拍攝的冷凍水合AFP的原始顯微照片。b.典型的AFP二維平均值。c.密度圖對(duì)應(yīng)的AFP原子模型。d.AFP的三維重建圖，分辨率為3.31 ?。e. AFP的整體冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。

圖3.hAFP冷凍電鏡分析

注：a.低溫電鏡數(shù)據(jù)處理工作流程。b.最終hAFP三維密度圖的局部分辨率估計(jì)。c.三維細(xì)化后的金標(biāo)準(zhǔn)傅里葉殼相關(guān)曲線（FSC=0.143）。d.最后一次結(jié)構(gòu)細(xì)化迭代中的粒子取向分布。e.歐拉角重構(gòu)分布。

圖4.AFP與HSA序列比對(duì)

注：AFP具有代表性的二級(jí)結(jié)構(gòu)元素顯示在序列上方。不變殘基和高度保守殘基分別用紅色陰影和紅色字母表示。參與二硫鍵形成的胱氨酸殘基用同樣的綠色數(shù)字表示。

2. AFP與HSA的結(jié)構(gòu)比較

人血清白蛋白（HSA）是血漿中含量最多的蛋白質(zhì)，半衰期為19天。HSA主要在成人肝臟中合成，HSA的功能包括維持血管中的膠體滲透壓，調(diào)節(jié)血液pH值，在炎癥條件下作為自由基的清除劑，并參與凝血和傷口愈合等過(guò)程。HSA在運(yùn)輸各種生物活性分子，包括蛋白質(zhì)、FA、激素、藥物和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)方面也起著至關(guān)重要的作用。這些功能取決于HSA的結(jié)構(gòu)特征，其內(nèi)部結(jié)合位點(diǎn)和表面活性基團(tuán)允許與許多生物分子相互作用并將其運(yùn)輸?shù)饺?。由于其血清濃度高、半衰期長(zhǎng)、再循環(huán)頻繁、無(wú)毒、無(wú)免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，HSA被廣泛用作各種治療分子的遞送載體。

AFP和HSA都屬于白蛋白家族，在卵黃囊和胎兒肝臟中合成比例較高。在體內(nèi)，AFP表現(xiàn)出與HSA相似的運(yùn)輸功能，包括將母體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如二十二碳六烯酸）通過(guò)胎盤(pán)屏障運(yùn)輸?shù)教海砻髌渥鳛樗幬镞f送載體的潛力。由于在某些癌細(xì)胞中存在特異性的AFP受體，AFP在癌癥治療的靶向藥物遞送方面比HSA更有潛力。

2.1 整體結(jié)構(gòu)

HSA和AFP的氨基酸序列高度同源，整體結(jié)構(gòu)非常相似。當(dāng)比較AFP和HSA-棕櫚酸（PDB:1E7H）的整體結(jié)構(gòu)時(shí)，結(jié)構(gòu)域II幾乎完全重疊。HSA和AFP蛋白在249被修剪的原子對(duì)之間的RMSD為1.186 ?（所有571對(duì)原子間的RMSD為5.763 ?）。與AFP相比，HSA的結(jié)構(gòu)域I更靠近蛋白的中心，亞結(jié)構(gòu)域IIIA/B也更靠近彼此（圖5a）。與HSA類(lèi)似，AFP顯示出大量的二硫鍵，賦予結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。AFP具有32個(gè)半胱氨酸殘基，它們都參與了16個(gè)二硫鍵的形成。相比之下，AFP比HSA少3個(gè)半胱氨酸殘基和1個(gè)二硫鍵。有趣的是，除了第一個(gè)二硫鍵外，其余AFP的二硫鍵位置與HSA的位置相對(duì)應(yīng)（圖5a）。分別比較AFP和HSA的子結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)每個(gè)子結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象幾乎相同（AFP的N端區(qū)域除外）。

2.2 FA結(jié)合位點(diǎn)

整體構(gòu)象差異可能是由配體或底物的結(jié)合引起的。比較AFP和HSA的FA結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)HSA比AFP結(jié)合的FA數(shù)量更多，并且兩種蛋白之間有一些結(jié)合位點(diǎn)重疊（圖5b）。將AFP的4個(gè)FA結(jié)合位點(diǎn)與HSA中的相應(yīng)位置進(jìn)行比較，AFP的FA結(jié)合位點(diǎn)2和4與HSA的FA結(jié)合位點(diǎn)6和5在結(jié)構(gòu)上相似。參與FA結(jié)合的氨基酸殘基的性質(zhì)也相似。AFP的FA結(jié)合位點(diǎn)1與HSA結(jié)合位點(diǎn)hsa7相對(duì)應(yīng)。兩個(gè)FA結(jié)合袋具有相似的構(gòu)象。然而，在HSA IIA和IA之間的界面處存在額外的FA結(jié)合，并且FA羧基通過(guò)與Tyr150、Arg257和Ser287側(cè)鏈的氫鍵錨定在HSA亞結(jié)構(gòu)域IIA中。在AFP中，Arg257和Ser287被非極性氨基酸Gly281和Gly311取代，這使得FA更容易與AFP IIA結(jié)合而不是IIA-IA交叉區(qū)。AFP的FA結(jié)合位點(diǎn)3與HSA結(jié)合位點(diǎn)3、4相對(duì)應(yīng)。

2.3 FA結(jié)合口袋

兩種蛋白結(jié)合袋的肽鏈骨架構(gòu)象相似，但口袋大小不同。與AFP相比，HSA在亞結(jié)構(gòu)域IIIA中與一個(gè)額外的FA結(jié)合位點(diǎn)。兩種蛋白與FA羧基相互作用的氨基酸殘基也不同。在HSA中，F(xiàn)A3與Ser342、Arg348和Arg485形成氫鍵，而FA4與Arg410、Tyr411和Ser489形成氫鍵。在AFP中，F(xiàn)A羧基靠近Tyr435和Ser513；Glu474與Arg372、Ser408和Arg509形成氫鍵，導(dǎo)致Glu474側(cè)鏈的運(yùn)動(dòng)穩(wěn)定和受限。在HSA中，Pro384與AFP中的Ser408相對(duì)應(yīng)，導(dǎo)致無(wú)法與Glu450建立氫鍵（與AFP中的Glu474相對(duì)應(yīng)）。在FA存在時(shí)，HSA的Glu450側(cè)鏈發(fā)生了向外的構(gòu)象波動(dòng)。AFP和HSA之間的這種結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致AFP的結(jié)合袋尺寸相對(duì)較小。因此，F(xiàn)A占據(jù)了AFP中大部分的結(jié)合口袋，從而阻礙了其結(jié)合過(guò)量FA的能力。

與HSA不同，AFP的IB亞結(jié)構(gòu)域不與FA結(jié)合。HSA與AFP之間參與FA結(jié)合的氨基酸性質(zhì)存在顯著差異，如Val141（AFP）與Arg117（HSA）對(duì)應(yīng)，Ala206/207（AFP）與Asp183（HSA）對(duì)應(yīng)。比較這兩種蛋白質(zhì)在亞結(jié)構(gòu)域上的差異，發(fā)現(xiàn)環(huán)的氨基酸組成發(fā)生了變化。與HSA相比，AFP在環(huán)中有兩個(gè)額外的氨基酸。兩個(gè)帶正電的精氨酸殘基（Arg114/Arg117）可能在HSA環(huán)中起重要作用。在AFP中，這些殘基對(duì)應(yīng)非極性氨基酸（Leu138/Val141）（圖5c），影響了結(jié)合袋的表面電荷和疏水性。因此，環(huán)的差異可能是這兩種蛋白質(zhì)在這個(gè)口袋中底物結(jié)合的決定因素。

2.4 子結(jié)構(gòu)域

對(duì)AFP和HSA的所有子結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)兩種蛋白之間幾乎所有的子結(jié)構(gòu)域都表現(xiàn)出相似的構(gòu)象。IA亞結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象差異主要集中在N端區(qū)域。AFP中的24個(gè)N端氨基酸（AA 19-42）形成一個(gè)環(huán)，其中來(lái)自另一個(gè)環(huán)的Cys37和Cys86形成一個(gè)二硫鍵（圖5c），穩(wěn)定了兩個(gè)環(huán)的構(gòu)象。此外，AFP的His22與來(lái)自IIA結(jié)構(gòu)域的三個(gè)氨基酸一起與金屬離子形成四面體配位，進(jìn)一步增強(qiáng)了環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。相比之下，HSA的N端氨基酸形成α螺旋，與其他螺旋一起形成一個(gè)小的疏水口袋。HSA FA2鏈尾部與這個(gè)口袋結(jié)合，其羧基錨定在結(jié)構(gòu)域IIA上（圖5c）。因此，F(xiàn)A與HSA結(jié)構(gòu)域I的結(jié)合使得結(jié)構(gòu)域I相對(duì)于結(jié)構(gòu)域II旋轉(zhuǎn)，從而促進(jìn)了連續(xù)疏水口袋的形成。這是HSA表現(xiàn)出更緊湊的整體構(gòu)象的原因之一。

圖5.AFP和HSA的整體結(jié)構(gòu)和脂肪酸結(jié)合袋比較

注：a.AFP（8X1N，洋紅色）和HSA（1E7H，黃綠色）的結(jié)構(gòu)比較。?黃綠色箭頭表示HSA相對(duì)于AFP偏移的方向。紅色虛線圈表示HSA比AFP多出二硫鍵。藍(lán)色虛線圈表示AFP和HSA之間不對(duì)應(yīng)的二硫鍵。b. AFP-FA（粉色）和HSA-FA（綠色）的結(jié)構(gòu)。脂肪酸是棕櫚酸（C16:0），在AFP和HSA中分別以洋紅色和深綠色表示。不同的FA結(jié)合位點(diǎn)用阿拉伯?dāng)?shù)字表示。c. AFP（8X1N，洋紅色）和HSA（1E7H，黃綠色）子域的結(jié)構(gòu)比較。FA在AFP中分別為紫色，在HSA中為深綠色。圖中標(biāo)出了與FA相關(guān)的氨基酸殘基。

2.5 小結(jié)

AFP和HSA是白蛋白家族的成員，表現(xiàn)出明顯的序列同源性。對(duì)它們的整體結(jié)構(gòu)和各個(gè)領(lǐng)域的比較分析揭示了驚人的相似之處，表明了潛在的功能相似性。AFP和HSA在血液中起天然運(yùn)輸載體的作用，可逆地與各種內(nèi)源性和外源性分子結(jié)合，以運(yùn)輸?shù)讲煌慕M織。AFP和HSA之間的一個(gè)顯著相似之處是它們對(duì)FA的高親和力。AFP中FA結(jié)合口袋的結(jié)構(gòu)特征在鑒定合適的FA治療分子中起著至關(guān)重要的作用。例如，AFP結(jié)合口袋的大小決定了最佳FA鏈長(zhǎng)度，以獲得更高的親和力和更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。此外，口袋入口周?chē)被釟埢臉O性和電荷會(huì)影響FA結(jié)合。因此，摻入適當(dāng)?shù)男揎椈鶊F(tuán)可以增強(qiáng)AFP和FA之間的親和力。然而，AFP和HSA并不相同，HSA比AFP具有更多的結(jié)合位點(diǎn)，這可能使其能夠與更多的生物分子相互作用。這可能是HSA成為成年人血液中最豐富的運(yùn)輸載體的原因之一。

參考文獻(xiàn)

Liu K, Wu C, Zhu M, et al. Structural characteristics of alpha-fetoprotein, including N-glycosylation, metal ion and fatty acid binding sites[J]. Commun Biol, 2024,7(1):505.

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