甲胎蛋白（AFP）的結(jié)構(gòu)功能、異質(zhì)性及配體

甲胎蛋白（AFP）是胚胎血漿中的一種主要大型糖蛋白，屬于白蛋白樣蛋白家族，分子量約為68kDa，由包含590個(gè)氨基酸殘基的單多肽鏈組成。甲胎蛋白由卵黃囊和胎兒肝臟產(chǎn)生。在妊娠12周左右，卵黃囊退化，胎兒肝臟成為AFP合成的主要部位。該蛋白在胎兒體內(nèi)的濃度很高（1-10mg/mL），但在出生后不久便急劇下降，到產(chǎn)后第二個(gè)月末，僅能檢出微量的AFP，幾乎完全被血清白蛋白所取代。妊娠期間甲胎蛋白含量的變化可用于胎兒異常的檢測(cè)，包括唐氏綜合征和神經(jīng)管開(kāi)放性缺陷，如脊柱裂。成人血漿中甲胎蛋白含量的顯著增加是肝細(xì)胞癌和卵黃囊瘤等幾種病理狀況發(fā)展的標(biāo)志。

1.AFP的功能

AFP具有多種生物活性，主要包括細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)功能。它能與雌激素相互作用，對(duì)脂肪酸和膽紅素具有高親和力，并能有效結(jié)合Cu²⁺和Ni²⁺離子。此外，AFP還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和代謝，與微噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞相互作用，抑制母體對(duì)胚胎的免疫反應(yīng)和患者對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)。

2.AFP的結(jié)構(gòu)

2.1AFP的分子形狀

從非晶體狀態(tài)下的原始空間結(jié)構(gòu)來(lái)看，AFP分子成V型不對(duì)稱結(jié)構(gòu)，含有三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域。分子左下“臂”結(jié)構(gòu)域之間存在多肽連接，這種多肽連接可能充當(dāng)“鉸鏈”，允許結(jié)構(gòu)域的靈活移動(dòng)，并促進(jìn)潛在配體的結(jié)合或釋放。

圖1.AFP的空間結(jié)構(gòu)

注：電子顯微鏡分析人類AFP（A）和牛AFP（B）的空間結(jié)構(gòu)。（C,D）為人和牛AFP的反質(zhì)圖。

2.2AFP的結(jié)構(gòu)域

AFP由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，分別為I、II和III，每個(gè)結(jié)構(gòu)域由大約195個(gè)氨基酸殘基組成。AFP分子的末端部分（總共有420個(gè)氨基酸殘基）被折疊成穩(wěn)定的獨(dú)立結(jié)構(gòu)域，即N端結(jié)構(gòu)域I和C端結(jié)構(gòu)域III，而AFP的中心結(jié)構(gòu)域（由170個(gè)氨基酸殘基組成的結(jié)構(gòu)域II）具有高度的靈活性，容易被胃蛋白酶消化。研究表明，結(jié)構(gòu)域III的氨基酸序列最保守，結(jié)構(gòu)域I的氨基酸序列最不保守。

2.3AFP的分子結(jié)構(gòu)

近紫外CD光譜強(qiáng)度反映了芳香氨基酸殘基結(jié)構(gòu)中的不對(duì)稱程度，表征了蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。紫外光譜強(qiáng)度的降低通常用于表征蛋白質(zhì)變性過(guò)程中三級(jí)結(jié)構(gòu)變化。天然AFP三級(jí)結(jié)構(gòu)為相對(duì)剛性的不對(duì)稱結(jié)構(gòu)。不同樣品中AFP的結(jié)構(gòu)特性差異較大，降低pH值，加熱或加入尿素會(huì)導(dǎo)致AFP剛性三級(jí)結(jié)構(gòu)變化，如pH3.0，或90℃，或9.5M尿素（圖2A）；配體釋放也會(huì)引起AFP三級(jí)結(jié)構(gòu)變化，且釋放天然配體后AFP三級(jí)結(jié)構(gòu)幾乎沒(méi)有差異（圖2）。與三級(jí)結(jié)構(gòu)不同，AFP二級(jí)結(jié)構(gòu)幾乎不受配體含量、配體釋放、以及溶液酸化的影響。

差示掃描微量熱法（DSC）顯示，AFP變性是一個(gè)不可逆的過(guò)程，這可能是由于蛋白質(zhì)變性過(guò)程中不可逆的配體釋放所致（圖3A曲線3）。配體組成的差異（由于分離程序的不同）可能會(huì)極大地影響蛋白質(zhì)的量熱行為，不同樣品中AFP的穩(wěn)定性和三級(jí)結(jié)構(gòu)都存在配體驅(qū)動(dòng)差異（圖3B）。不同純化程序?qū)е屡潴w釋放，AFP三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（圖3B），在某種程度上不同的天然配體含量，可能因分離程序不同而存在差異。蔗糖是AFP的天然配體之一，在蔗糖存在的情況下，熔化過(guò)程更為復(fù)雜（圖3C），這表明配體可能在AFP空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中起著至關(guān)重要的作用。

圖2.AFP的近紫外CD光譜

注：（A）不同實(shí)驗(yàn)條件下，金屬親和純化AFP的近紫外CD光譜，1、pH7.0、23℃；2、pH3.0， 23℃；3、pH7.0，90℃；4、pH7.0，尿素9.5M。（B）天然配體對(duì)甲胎蛋白剛性三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。圖中為通過(guò)金屬親和（1）或不同的免疫親和方法（3和4）從人臍帶血清中分離出的蛋白的近紫外CD光譜。圖中也顯示了無(wú)配體（2）和完全未折疊蛋白（5）的光譜以供比較。

圖3.AFP偏摩爾熱容的溫度依賴性

注：（A）為不同實(shí)驗(yàn)條件下金屬親和層析分離蛋白的量熱曲線：1、pH7.0；2、pH3.0；3、在pH7.0下對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行重復(fù)溫度掃描的結(jié)果。（B）為用金屬親和法（1）或兩種不同的免疫親和法（3和4）從人臍帶血清中分離的AFP樣品測(cè)得的量熱曲線，也顯示了無(wú)配體形式的熔化（2）。（C）金屬親和純化的AFP在0.2%蔗糖存在下的熔化，虛線表示由量熱曲線分解引起的兩個(gè)簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)變。

2.4AFP的構(gòu)象穩(wěn)定性

眾所周知，盡管蛋白質(zhì)具有廣泛的結(jié)構(gòu)空間，但它具有嚴(yán)格的構(gòu)象，在溶液中可以存在多種穩(wěn)定的有序構(gòu)象，在一定條件下，多肽鏈可以由有序構(gòu)象變?yōu)闊o(wú)序構(gòu)象，反之亦然。這種構(gòu)象轉(zhuǎn)變是對(duì)外部條件（如溫度、pH值或溶劑組成）變化的反應(yīng)。

對(duì)于AFP來(lái)說(shuō)，即使是a.在pH4.5~10.5范圍內(nèi)；b.尿素濃度低于7.5 M（pH7.5）；c.鹽酸胍濃度低于2.0M（pH7.5）時(shí)，仍然具有較高的構(gòu)象穩(wěn)定性。AFP具有極高的構(gòu)象穩(wěn)定性很可能是由于大量的二硫鍵（15個(gè)），天然配體顯著增加了AFP的穩(wěn)定性。

2.5AFP變性的不可逆性

研究中顯示，任何一種AFP變性（由pH值降低或溫度升高引起，或由尿素、GdmCl變性引起）都是不可逆的，這種不可逆性是由不可挽回的配體釋放引起的。無(wú)配體的AFP具有致密的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但沒(méi)有剛性三級(jí)結(jié)構(gòu)。

造成AFP重折疊和配體釋放的不可逆性原因可能有兩種。第一種，形成結(jié)構(gòu)的配體結(jié)合位點(diǎn)和碳水化合物（糖基化修飾）的附著位點(diǎn)，在空間上相對(duì)較近。在這種情況下，AFP的寡糖成分可能起到帽子的作用，調(diào)節(jié)配體進(jìn)出蛋白質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)（圖4A）。在天然狀態(tài)下，配體結(jié)合在AFP的疏水性口袋內(nèi)，并且“門被糖部分鎖定”（圖4A-1）。在輕度變性條件下，配體可以很容易地從蛋白質(zhì)上去除（圖4A-2）。當(dāng)變性分子恢復(fù)到生理?xiàng)l件時(shí)，它開(kāi)始折疊，碳水化合物與AFP的非共價(jià)相互作用篩選疏水口袋，阻止配體正常滲透到其結(jié)合位點(diǎn)（圖4A-3）。

第二種，AFP重折疊和配體釋放的不可逆性可能與非天然AFP分子的自結(jié)合有關(guān)（圖4B）。蛋白質(zhì)重折疊常伴有部分折疊的中間體短暫結(jié)合。結(jié)合或聚集傾向是非天然蛋白質(zhì)的一般性質(zhì)，即使在天然狀態(tài)下，當(dāng)濃度足夠高（0.5-1.0mg/mL）時(shí)，AFP也傾向于形成二聚體。因此，人們推測(cè)部分折疊的AFP分子自結(jié)合（甚至是簡(jiǎn)單的二聚化，如圖4B所示）可以篩選配體結(jié)合位點(diǎn)，從而阻止配體與AFP的相互作用。目前，這兩種可能性還有待進(jìn)一步研究。

圖4.AFP中疏水配體釋放不可逆性示意圖

注：（A）糖基化、（B）結(jié)合決定的不可逆性。

3.AFP的異質(zhì)性

3.1AFP免疫化學(xué)異質(zhì)性

研究發(fā)現(xiàn)AFP分子上有16個(gè)不同的表位，根據(jù)交叉反應(yīng)性將這些表位分為5個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)簇（A-E）和7個(gè)單表位。AFP在D簇的可接近性上存在差異，具有開(kāi)放性表位的AFP，D簇與相應(yīng)的單克隆抗體反應(yīng)；具有隱性表位的AFP，僅在部分變性后才能與單克隆抗體反應(yīng)。已知106和108是隱性表位，隱藏表位D、106或108僅在部分AFP分子中表達(dá)，106、108和D簇表位的變化，被認(rèn)為是AFP構(gòu)象變化的標(biāo)志。不同來(lái)源AFP中D、106表位表達(dá)差異很大。研究顯示，生殖細(xì)胞腫瘤患者的血清和肝細(xì)胞癌患者的血清中AFP傾向于D-和106-表位形式，羊水AFP傾向于D⁺和106⁺形式。

不同構(gòu)象的AFP具有相同的分子質(zhì)量和相互轉(zhuǎn)換的特征。蔗糖可以穩(wěn)定AFP的天然狀態(tài)，將D⁺、106⁺和108⁺形式的AFP分子幾乎完全轉(zhuǎn)化為D^-、106^-和108^-變體。在0.2%蔗糖條件下，D⁺和106⁺可以轉(zhuǎn)化為D^-和106^-。硝基纖維素或塑料吸收AFP，而D^-在硝化纖維素上固定后可以轉(zhuǎn)化為D⁺，另外添加45%甲醇可增強(qiáng)表位D、106和108的表達(dá)。

3.2AFP電荷異質(zhì)性

不同方法分離的AFP樣本通常在免疫上是均勻的，但總存在電荷非均質(zhì)性。在pH值4.5-5.2范圍內(nèi)，使用等電聚焦法則發(fā)現(xiàn)了9種AFP變體。從人羊水或臍帶血中分離出7種不同電荷形式的AFP，而從不同肝癌來(lái)源分離的AFP比從胎兒組織或羊水分離的AFP表現(xiàn)出更多的電荷異質(zhì)性，此外，新鮮人類肝癌AFP樣品在儲(chǔ)存過(guò)程中電荷異質(zhì)性會(huì)增加。

這導(dǎo)致電荷異質(zhì)性的原因可能有三種：氨基酸序列的差異、糖基化或配體結(jié)合。同一物種AFP的電荷異質(zhì)性與氨基酸組成的差異無(wú)關(guān)。蛋白質(zhì)碳水化合物成分的差異只能解釋部分電荷差異，因?yàn)橛蒙窠?jīng)氨酸酶處理AFP可以消除部分異質(zhì)性，因此同一物種中AFP電荷異質(zhì)性主要與配體結(jié)合有關(guān)。從人胎兒組織中分離的AFP含有兩種成分，其等電點(diǎn)分別為4.7和5.3。等電點(diǎn)的值取決于天然配體（脂肪酸）的含量，pI4.7的AFP結(jié)合脂肪酸，pI5.3成分未結(jié)合脂肪。通過(guò)去除脂肪酸，這些異質(zhì)AFP分離物可以轉(zhuǎn)化為基本均勻的物質(zhì)（pI為5.3）。在非變性條件下，制備的AFP存在多種組分，但在SDS凝膠電泳中AFP通常顯示為單帶。

4.AFP與配體

4.1AFP的配體運(yùn)輸和釋放

AFP與細(xì)胞膜相互作用，由于局部pH值和有效介電常數(shù)的降低，細(xì)胞膜環(huán)境可能發(fā)生變性。這意味著當(dāng)AFP與膜表面相互作用時(shí)，可能發(fā)生某些蛋白質(zhì)的變性。這種由膜誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為熔融球狀狀態(tài)具有重要的功能，促進(jìn)了跨膜蛋白質(zhì)運(yùn)輸和毒素滲透到細(xì)胞中。

熔融球狀中間態(tài)，是一種致密中間體，它們沒(méi)有剛性的三級(jí)結(jié)構(gòu)，但具有類似原生的二級(jí)結(jié)構(gòu)。剛性天然蛋白分子向熔融球體的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，可以增加靈活性，促進(jìn)疏水配體的釋放。研究表明，與破壞AFP剛性三級(jí)結(jié)構(gòu)的條件不同，要想AFP二級(jí)結(jié)構(gòu)重排，致密性發(fā)生改變，需要更高濃度的有機(jī)溶劑（如甲醇、三氟乙醇）。

4.2配體對(duì)AFP結(jié)構(gòu)的影響

配體在維持AFP的剛性空間結(jié)構(gòu)中起著至關(guān)重要的作用。在無(wú)配體形式下，該蛋白呈現(xiàn)熔融的球狀構(gòu)象，顯示出緊湊的天然二級(jí)結(jié)構(gòu)與缺乏獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)組合。熔融球態(tài)的模型是一種“半剛性”分子，它保留了天然折疊模式的主要特征，但具有更大的內(nèi)部運(yùn)動(dòng)，包括許多內(nèi)部側(cè)鏈的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)化。這些特性對(duì)于活細(xì)胞蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器或膜（疏水）環(huán)境中調(diào)整自身以適應(yīng)不同的條件是很有利的。

4.3配體對(duì)AFP功能的影響

AFP的空間結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性對(duì)天然配體的存在高度敏感。如前所述，AFP至少有兩種功能，運(yùn)輸和免疫調(diào)節(jié)。由于該蛋白具有嚴(yán)格的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，因此認(rèn)為該蛋白的功能也可能受到配體的調(diào)節(jié)。關(guān)于AFP的主要配體仍有很大爭(zhēng)議，例如肝癌來(lái)源的AFP配體（一種特定脂肪酸）的類型和數(shù)量都有很大的變化。

配體釋放介導(dǎo)的AFP分子從天然狀態(tài)向熔融球狀狀態(tài)的不可逆構(gòu)像轉(zhuǎn)變，可能代表了AFP從無(wú)活性形式到活性（免疫抑制）形式的轉(zhuǎn)變，這種轉(zhuǎn)變對(duì)免疫調(diào)節(jié)功能至關(guān)重要。

此外，AFP的體外免疫抑制特性差異很大，而這種變化并不是由糖基化程度引起的，因?yàn)橥粊?lái)源的AFP變體碳水化合物含量沒(méi)有顯著差異。研究發(fā)現(xiàn)，低pH值或高離子強(qiáng)度可以影響AFP生物效力，純化過(guò)程可能會(huì)使AFP變性，發(fā)生不可逆構(gòu)象轉(zhuǎn)變，影響其免疫調(diào)節(jié)活性。

圖5.AFP配體飽和形式轉(zhuǎn)化為無(wú)配體形式示意圖

注：圖5代表了AFP內(nèi)吞作用和脂肪酸向靶細(xì)胞轉(zhuǎn)移的雙受體模型。該模型是基于不同細(xì)胞對(duì)AFP和脂肪酸（FA）攝取的大量研究提出的。根據(jù)該模型，細(xì)胞表面有兩種不同的受體（AFP-和FA-結(jié)合位點(diǎn)）。配體飽和的AFP與相應(yīng)的受體結(jié)合產(chǎn)生內(nèi)吞作用信號(hào)。另一方面，AFP與受體的相互作用使蛋白分子進(jìn)入膜表面輕度變性環(huán)境，蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化，伴隨AFP-FA復(fù)合物解離。隨后FA被轉(zhuǎn)移，與附近的FA受體結(jié)合。無(wú)配體的AFP可以與AFP受體分離，也可以通過(guò)內(nèi)吞作用與脂肪酸一起轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。這種無(wú)配體的熔融球狀A(yù)FP可以作為免疫調(diào)節(jié)劑。

參考文獻(xiàn)

Gillespie JR, Uversky VN. Structure and function of alpha-fetoprotein: a biophysical overview. Biochim Biophys Acta[J]. 2000,1480(1-2):41-56.?

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