液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測25-羥維生素D標(biāo)準(zhǔn)化專家共識

中國老年保健醫(yī)學(xué)研究會檢驗醫(yī)學(xué)分會, 中國老年醫(yī)學(xué)學(xué)會檢驗醫(yī)學(xué)分會
中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2021, 44(7): 587-595

臨床血清維生素D檢測方法主要為化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescent immunoassay，CLIA）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography- tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）。從檢測原理出發(fā)，LC-MS/MS是基于被測生物標(biāo)志物本身分子量、結(jié)構(gòu)等化學(xué)性質(zhì)的直接分析法，因此具有獨特高靈敏度、高特異性和高通量特點。CLIA是基于抗原抗體反應(yīng)，與LC-MS/MS相較，前處理簡單且檢測自動化程度高，但存在特異性低、線性范圍窄和檢測結(jié)果可比性差等問題。

目前LC-MS/MS檢測25-羥維生素D［25(OH)D］的方法大多為實驗室自建方法，雖然已有多類質(zhì)譜檢測試劑盒陸續(xù)上市，但方法缺乏標(biāo)準(zhǔn)化。另外，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的缺乏或不適當(dāng)使用、質(zhì)量保證措施的不完整均可導(dǎo)致檢測結(jié)果的偏差甚至錯誤。LC-MS/MS檢測血清25(OH)D方法的標(biāo)準(zhǔn)化是其在臨床實驗室成功應(yīng)用的必要條件，也是保證方法之間一致性和可比性的核心要素。本專家共識旨在建立標(biāo)準(zhǔn)化的血清25(OH)D檢測方法，從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物的選擇、儀器與試劑的準(zhǔn)備、檢測方法注意事項、質(zhì)量控制管理、人員要求及參考區(qū)間等方面提出建議。

術(shù)語及定義

1. 25(OH)D：人體血液中維生素D的主要循環(huán)形式包括25(OH)D2和25(OH)D3，其中25(OH)D3為主要存在形式，因其穩(wěn)定性好，可作為評價人體維生素D水平的可靠指標(biāo)。

2. 內(nèi)標(biāo)：加入到待測樣品中，作為測定待測組分含量的參照標(biāo)準(zhǔn)及其已知質(zhì)量或含量純物質(zhì)。

3. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：具有足夠均勻且穩(wěn)定的特定特性物質(zhì)，其特性適用于測量及標(biāo)稱特性檢查的用途。

4. 有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：附有由權(quán)威機構(gòu)發(fā)布文件，提供使用有效程序獲得且具有不確定度和溯源性的一個或多個特性值標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

5. 定量下限（limit of quantitation， LOQ）：在規(guī)定的測量條件下，以指定的測量不確定度能測量的樣品中可被測量的最低值。

維生素D主要代謝路徑

人體維生素D主要來源于皮膚經(jīng)陽光作用合成的維生素D₃，另一種來源是食物中（如經(jīng)光照后的蘑菇、野生海魚等）的維生素D₂，兩者通過肝臟代謝后以2種形式存在，分別是25(OH)D₂和25(OH)D₃，雖然人體血液中超過95%的25(OH)D為25(OH)D₃，但仍存在少量25(OH)D₂，若補充外源性25(OH)D₂，則體內(nèi)可檢測出濃度較高的25(OH)D₂，因此需分別對25(OH)D₂和25(OH)D₃進行定量檢測。25(OH)D在腎臟和其他組織中轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩锘钚缘亩u基代謝物1，25-羥基維生素D［1，25-(OH)₂D］，該物質(zhì)經(jīng)過維生素D結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)運至靶器官，與維生素D受體結(jié)合，從而發(fā)揮其生理作用（圖1）。1，25-(OH)₂D在人體內(nèi)的濃度低（pg/ml級別）、半衰期短，檢測難度較大，而25(OH)D因其濃度高、穩(wěn)定、半衰期較長，是反映機體維生素D代謝的重要檢測指標(biāo)。

圖1 維生素D代謝途徑

LC-MS/MS技術(shù)

LC-MS/MS是通過質(zhì)量分析器測定帶電粒子質(zhì)荷比的一種分析技術(shù)；MS/MS是將2個質(zhì)量分析器由碰撞室串接起來的分析設(shè)備，即三重四極桿質(zhì)譜儀。第一級質(zhì)量分析器篩選出被離子化的樣本中特定質(zhì)荷比的母離子，母離子進入碰撞室，通過碰撞誘導(dǎo)解離的方式形成碎片子離子；第二級質(zhì)量分析器篩選出特異性強的定量子離子及定性子離子，子離子進入檢測器監(jiān)測，最終得到目標(biāo)分析物的含量。每個母離子/子離子對被稱為1個離子對，只有具有特定離子對的待測物質(zhì)，才能進入檢測器。因此，MS/MS具有很好的檢測特異性。此外，質(zhì)譜方法具有同時監(jiān)測多離子通道多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）的獨特優(yōu)勢，即使在檢測背景信號高的內(nèi)源性化合物時，亦可通過同時監(jiān)測2個離子碎片通道，實現(xiàn)待測物質(zhì)的精準(zhǔn)檢測。

關(guān)鍵質(zhì)量要素

1.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的選擇

具有溯源性的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是實現(xiàn)量值溯源、檢測結(jié)果準(zhǔn)確一致的重要保證。應(yīng)選用國家級權(quán)威機構(gòu)有的證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，若不可獲得相關(guān)權(quán)威機構(gòu)或國際公認(rèn)的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，則其他獲得相關(guān)國家認(rèn)可委員會標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者認(rèn)可的提供明確溯源途徑和測量不確定度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可作為替代選擇。

表1 25-羥基維生素D標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息

機構(gòu)	標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)	貨號/編碼
中國計量科學(xué)研究院	冰凍人血清中25-羥基維生素D標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)	NIM-RM3698-3700
美國國家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究院	25-羥基維生素D校準(zhǔn)溶液	SRM 2972a
	冰凍人血清中維生素D代謝物	SRM 972a
	冰凍人血清中維生素D代謝物（高濃度）	SRM 2973
美國Cerilliant公司	25-羥基維生素D₂	H-073
美國Cerilliant公司	25-羥基維生素D₃	H-083

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2.內(nèi)標(biāo)物的選擇

1）內(nèi)標(biāo)物的作用

內(nèi)標(biāo)物可用于校正基質(zhì)效應(yīng)以及樣本前處理、色譜分離和離子化過程引入的偏差，有助于提高定量分析的準(zhǔn)確度和精密度。

2）推薦內(nèi)標(biāo)

推薦使用25(OH)D的穩(wěn)定同位素標(biāo)記物作為內(nèi)標(biāo)品，一般有：氘代或¹³C同位素內(nèi)標(biāo)。

3）內(nèi)標(biāo)物要求

內(nèi)標(biāo)物至少比目標(biāo)分析物大3個分子量。內(nèi)標(biāo)物化學(xué)純度≥98%，同位素標(biāo)記純度≥97%，如果低于該純度，則其未標(biāo)記的化合物濃度會與25(OH)D₂或25(OH)D₃的檢測下限接近，導(dǎo)致檢測結(jié)果系統(tǒng)性偏高。必要時應(yīng)對內(nèi)標(biāo)物純度進行測試，以避免其中含有與目標(biāo)分析物共洗脫且具有相同質(zhì)量數(shù)的干擾物質(zhì)。

表2 可選內(nèi)標(biāo)品信息

機構(gòu)或組織	內(nèi)標(biāo)品	產(chǎn)地	貨號
Iso Sciences	25-羥基維生素D₂-d₃	美國	4176
西格瑪-奧德里奇（Sigma-Aldrich）	25-羥基維生素D₂-d₃	美國	705888
劍橋同位素（Cambridge isotope laboratories）	25-羥基維生素D₃-d₆	美國	DLM-7708
多倫多化學(xué)（Toronto Research Chemicals）	25-羥基維生素D₃-d₆	加拿大	C125702
曼哈格 BePure	25-羥基維生素D₂-d₃	中國	MD-0005
	25-羥基維生素D₂-d₆	中國	MD-0005D6
	25-羥基維生素D₂-¹³C₃	中國	MC-0005
	25-羥基維生素D₃-¹³C₃	中國	MC-0010
	25-羥基維生素D₃-d₃	中國	MD-0010
	25-羥基維生素D₃-d₆	中國	MD-0011D6
貝塔醫(yī)藥	25-羥基維生素D₂-d₆	中國	BTS-VD2-d6
貝塔醫(yī)藥	25-羥基維生素D₃-d₆	中國	BTS-VD3-d6

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注：因25(OH)D₂-d₆[m+1]⁺(m/z 419)脫水形成的子離子(m/z 401)與25(OH)D₃的分子離子峰[m+1]⁺(m/z 401)有相同質(zhì)荷比，易與25(OH)D₃特別是其異構(gòu)體3-epi-25(OH)D₃檢測發(fā)生干擾，一般建議在使用氘代內(nèi)標(biāo)時選用25(OH)D₂-d₃作為內(nèi)標(biāo)。

3.樣本前處理方法的選擇

生物樣本分析的主要障礙包括濃度低、干擾大、個體差異大等，樣品處理目的主要是去除樣品中的雜質(zhì)，富集樣品。針對血清25(OH)D的檢測，如果儀器靈敏度高，蛋白沉淀法可作為首選的樣品處理方法，具有耗時少，簡單、經(jīng)濟等優(yōu)點，但需要進行適當(dāng)?shù)纳V分離，以減少基質(zhì)效應(yīng)。固液萃取（solid liquid extraction， SLE）和固相萃取法（solid phase extraction， SPE）雖然可以去除樣品的基質(zhì)及富集樣品，但其洗脫效率容易受到洗脫耗材批次差異的影響，需要進行不同廠家及不同批次的比對。

4.色譜條件選擇

根據(jù)被測化合物的特性，進行流動相的優(yōu)化，盡量避免使用非揮發(fā)性鹽、無機酸、表面活性劑等流動相添加劑，盡量不用或少用極低濃度（< 0.02%）的流動相添加劑。此外，25(OH)D₃與3-epi-25-羥基維生素D₃［3-epi-25(OH)D₃］為同分異構(gòu)體。在學(xué)齡兒童體內(nèi)，3-epi-25(OH)D₃占25(OH)D的2.5%~17%，在出生后前3個月嬰兒體內(nèi)，3-epi-25(OH)D₃濃度較高，占25(OH)D濃度的60%，在成人中占比較低，偶爾可高達22%。25(OH)D₃與3-epi-25(OH)D3質(zhì)荷比一致，導(dǎo)致無法通過質(zhì)譜直接分離，一般可通過色譜分離的方式使這2種分析物具有不同保留時間；當(dāng)分離度達到1.5時，可忽略3-epi-25(OH)D₃對25(OH)D₃檢測的影響。如果需要進行3-epi-25(OH)D₃的分離，則需確保色譜條件可以實現(xiàn)其與25(OH)D₃的基線分離，參考譜圖見圖2。

圖2 25(OH)D2和25(OH)D3檢測色譜圖

5.質(zhì)譜參數(shù)選擇

LC-MS/MS定量分析推薦一個分析物使用2個離子通道，分別作為定量離子通道和定性離子通道。25(OH)D₂和25(OH)D₃是水解代謝產(chǎn)物，熱不穩(wěn)定及離子化過程中也容易形成脫水子離子。需要注意的是其在基質(zhì)中的背景噪音偏高，應(yīng)避免選擇脫水的子離子碎片（即母離子減少18的碎片離子）。但如果大氣壓化學(xué)電離源作為離子化模式，其在離子源中完全脫水形成穩(wěn)定的脫水離子可以作為母離子。在任何給定時間內(nèi)監(jiān)測到的離子對通道越多，單個色譜峰可采集到的數(shù)據(jù)點就越少，如果用于表征色譜峰面積的數(shù)據(jù)點數(shù)量不足，數(shù)據(jù)的可靠性可能會受到影響，掃描時間單個色譜峰包含至少10個（建議15～20個）數(shù)據(jù)點。此外，優(yōu)化離子通道內(nèi)延遲時間，以避免碎片離子間發(fā)生交叉干擾。初步確定碰撞池電壓和碰撞池能量后，建議使用提取樣本進樣以獲得基質(zhì)樣本中最佳信噪比的碎片離子。

25(OH)D檢測

1.試劑

（1）二類25-羥維生素D檢測試劑盒：可溯源至可獲得的最高級別標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線：建議25(OH)D2的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍至少包含2～100 ng/mL區(qū)間，25(OH)D₃的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍至少包含5～250 ng/mL區(qū)間，并且在選定的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)一般分散設(shè)置4～5個濃度點。

（3）質(zhì)控樣本：單獨配制質(zhì)控樣本的初級工作液。質(zhì)控樣本基質(zhì)應(yīng)盡量和患者樣本基質(zhì)保持一致，以減小樣本處理和離子化中的基質(zhì)效應(yīng)。建議配制2～3個濃度質(zhì)控樣本，濃度范圍建議在臨床參考區(qū)間的基礎(chǔ)上（分布于正常和異常參考區(qū)間），結(jié)合分析方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線綜合設(shè)定，通常為標(biāo)準(zhǔn)曲線中3倍左右的LOQ、中間濃度±20%和70%～80%的定量上限，以確保不同濃度未知樣本的準(zhǔn)確性。

2.樣本要求

本方法適用于新鮮、冷凍或凍干血清樣本的25(OH)D₂和25(OH)D₃濃度檢測。

3.參考區(qū)間

表3 不同文獻規(guī)定的25(OH)D的臨床參考區(qū)間

來源	正常		缺乏		不足		嚴(yán)重不足
來源	ng/mL	nmol/L	ng/mL	nmol/L	ng/mL	nmol/L	ng/mL	nmol/L
WS/T 677-2020人群維生素D缺乏篩查方法	≥20	≥50	≥12～<20	≥30～<50	<12	<30	-	-
維生素D及其類似物臨床應(yīng)用共識	>30	>75	20～30	50～75	<20	<50	<10	<25

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注：“-”表示引文中無此項內(nèi)容。

4.報告發(fā)布

根據(jù)《GB/T 22576.1-2018/ISO 15189：2012》進行檢測結(jié)果的報告發(fā)布，報告前綜合評估：質(zhì)控是否在控，與此前結(jié)果是否一致，樣本質(zhì)量等因素進行綜合考量。此外，建議各實驗室報告單上分別顯示25(OH)D2、25(OH)D3和25(OH)D的含量。

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